În anul 1609, atunci când s-a semnat decretul regal conform căruia toate bisericile ortodoxe au trecut sub ascultarea și jurisdicția mitropolitului uniat, mai mulți membri ai Bisericii Ortodoxe s-au luptat pentru drepturile lor și, astfel, Mănăstirea Sfântului Duh a fost singurul așezământ bisericesc din Vilnius care a rămas în Biserica Ortodoxă.

În 1634 biserica de lemn a mănăstirii a fost înlocuită cu una de piatră. Altarul principal a fost afierosit Pogorârii Duhului Sfânt, iar cele două paraclise laterale au primit hramul Sfântului Ioan Teologul și, respectiv, al Sfinților Împăraţi Constantin și Elena.

Din pricina incendiilor și a tulburărilor ce au avut loc în Lituania, mănăstirea a fost reconstruită de mai multe ori de atunci. Ultima refacere a avut loc în anul 1873.

În Mănăstirea Sfântului Duh din Vilnius se păstrează o copie a icoanei Maicii Domnului „Călăuzitoarea” din Vilnius. Icoana este prăznuită pe 15 februarie (ziua mutării sale în Lituania, 1495) şi pe 14 aprilie (ziua pomeniri Sfinților Mucenici și frați Antonie, Ioan și Eustație din Lituania).