Biserica Bărboi a fost construită între anii 1841-1843, și este opera arhitectului Andrei Caridis ajutat de către meșterii Atanasie și Gheorghe, greci din Șisani, pe fundația unei biserici datând din 1615 (Sfânta Vineri) construită de vornicul Ioan Ursu Barboi. 

În 1669 se transformă în mănăstire și este închinată mănăstirii Vatoped de la muntele Athos. În 1821 biserica a fost grav avariată și apoi demolată în 1829. 

Pe locul vechii biserici, între 1841-1843, marele logofăt Dimitrie Sturza si soția sa Elena, cu sprijinul financiar al mănăstirii Vatopedi și cu osteneala mitropolitului Grigore Irinupoleos s-a construit actuala biserică. 

În urma cutremurului din 4 martie 1977, biserica a suferit avarii la structura bolților și a turlelor, existând riscul de prăbușire. De aceea, Părintele Patriarh Teoctist, pe atunci Mitropolit al Moldovei și Sucevei, a inițiat lucrări de restaurare care au inclus şi turnul clopotniţă, precum şi reabilitarea casei parohiale şi a casei de ape. Slujba de sfințire a fost săvârşită de către Părintele Patriarh Teoctist în ziua de 27 noiembrie 1988.

Biserica și-a recăpătat strălucirea pe 19 iunie 2022, cu prilejul resfințirii sfântului locaș, la care au luat parte IPS Mitropolit Teofan și PS Varlaam Ploieșteanul, Episcop-vicar patriarhal, dimpreună cu un sobor numeros de preoți și diaconi. Pe 12 februarie 2023, Mănăstirea Bărboi a fost reînființată, avându-l ca stareț pe părintele arhimandrit, lector universitar doctor Nathanael Neacșu. 

În această biserică își au mormântul, pe lângă Ioan Sandu Sturdza, primul domn pământean din 1822, și alți membri importanți ai familiei Sturza. Tot în biserică într-o nișă, în peretele sudic, au fost depuse osemintele poetului Alecu Russo, cel ce a scris poemul „Cântarea României”. 

Tot aici a fost diacon și a locuit în casa parohială Ion Creangă între anii 1863 și 1865. În turn a fost găsită biblioteca scriitorului Costache Conachi. 

Interiorul bizantin al bisericii a fost construit din piatră și cărămidă. Porticul, susținut de coloane dorice este realizat în stil clasic, în timp ce turla prezintă elemente romanice neogotice. 

Datorită formei și dimensiunilor ei, Biserica Bărboi este replica moldovenească a unor edificii similare de pe Muntele Athos. Biserica - are planul în formă de cruce greacă după modelul celor de la Muntele Athos. Are o formă dreptunghiulară cu abside mici la E, N și S. Intrarea principală este marcată de un portal impozant susținut pe 6 coloane din piatră cu capiteluri dorice. 

Biserica are o turlă centrală cu deschidere mare ce se dezvoltă pe o bază pătrată. Turla centrală este încadrată de 4 turle cu deschidere mult mai mică și care au baze octagonale. Parametrul exterior al bisericii este compus dintr-o alternanță de blocuri de piatră de talie și șiruri de carămidă. Interiorul bisericii spațios este compus din 3 nave una centrală și 2 laterale desparțite prin coloane de marmură de Carara care au la partea superioară capiteluri în stil corintic.

Ansamblul Bărboi a fost ctitorit de Ion Ursu Bărboi în prima jumătate a secolului al XVII-lea, prin zidirea unei biserici în stil moldovenesc, cu turlă pe naos, și a dăinuit până spre jumătatea secolului al XIX-lea. Cutremurul din 1829 și alți factori distructivi au afectat puternic biserica, ajungându-se în imposibilitatea de a se sluji în ea. Descendenți ai ctitorului Bărboi, familia logofătului Dumitru Sturdza și alți membri ai familiei lor, ajutați de diverși credincioși și de obștea monahală a Mănăstirii Bărboi, au rezidit din temelie actuala biserică, între anii 1841-1844, având ca arhitect și supraveghetor al lucrărilor pe Andrei Karidis.