Ansamblul Bărboi a fost ctitorit de Ion Ursu Bărboi în prima jumătate a secolului al XVII-lea, prin zidirea unei biserici în stil moldovenesc, cu turlă pe naos, și a dăinuit până spre jumătatea secolului al XIX-lea. Cutremurul din 1829 și alți factori distructivi au afectat puternic biserica, ajungându-se în imposibilitatea de a se sluji în ea. Descendenți ai ctitorului Bărboi, familia logofătului Dumitru Sturdza și alți membri ai familiei lor, ajutați de diverși credincioși și de obștea monahală a Mănăstirii Bărboi, au rezidit din temelie actuala biserică, între anii 1841-1844, având ca arhitect și supraveghetor al lucrărilor pe Andrei Karidis. În urma cutremurului din 4 martie 1977, biserica a suferit avarii la structura bolților și a turlelor, existând riscul de prăbușire. De aceea, Părintele Patriarh Teoctist, pe atunci Mitropolit al Moldovei și Sucevei, a inițiat lucrări de restaurare care au inclus şi turnul clopotniţă, precum şi reabilitarea casei parohiale şi a casei de ape. Slujba de sfințire a fost săvârşită de către Părintele Patriarh Teoctist în ziua de 27 noiembrie 1988.

Biserica și-a recăpătat strălucirea pe 19 iunie 2022, cu prilejul resfințirii sfântului locaș, la care au luat parte IPS Mitropolit Teofan și PS Varlaam Ploieșteanul, Episcop-vicar patriarhal, dimpreună cu un sobor numeros de preoți și diaconi. Pe 12 februarie 2023, Mănăstirea Bărboi a fost reînființată, avându-l ca stareț pe părintele arhimandrit, lector universitar doctor Nathanael Neacșu.