A avut o importantă contribuție în realizarea Unirii Principatelor române din 1859. În a doua jumătate a anului 1859 a intrat în conflict cu domnul Alexandru Ioan Cuza pe problema administrării averilor mănăstirilor pământene. Motivând că nu sunt bine chivernisite, guvernul a hotărât ca o parte din bunurile acestora să intre sub administrarea statului. Au avut de suferit mănăstiri precum Neamț-Secu (aflate atunci sub aceeași conducere), Agapia, Văratic, Vorona, iar mănăstirile Doljești și Zagavia au fost desființate. Mitropolitul Sofronie Miclescu și-a exprimat dezacordul față de aceste măsuri, fiind cunoscut acel episod în care ministrul Cultelor, aducându-i raportul pe care ierarhul îl înaintase domnului în semn de protest față de măsurile care îi încălcau flagrant autoritatea, i-a adresat următoarele cuvinte: „Măria Sa m-a trimis să-ți înapoiez raportul acesta și să ți-l arunc în obraz, și dacă nu te vei mărgini la aceasta, te va trata ca pe un călugăr de rând” (N. Dobrescu). Mitropolitul a răspuns energic, apărând cu demnitate drepturile Bisericii: ,,Va să zică Vodă a găsit că eu am obraz, dar Măria Sa n-a avut obraz să împlinească cererea Bisericii. Să-i spui că Alexandru cel dintâi a înzestrat Biserica, iar Alexandru cel de-al doilea o pradă. Am să trag clopotele tuturor bisericilor şi am să spun samavolniciile sale”. (Constantin N. Tomescu, Scurtă povestire istorică despre Sfânta Mănăstire Neamţu şi despre aşezările monahale supuse ei (mănăstirea Secu şi schiturile Vovidenia, Pocrov, Sihăstria, Sihla şi Icoana), 1942, p. 55)

La 7 noiembrie 1860 Guvernul Mihail Kogălniceanu a emis decretul de suspendare a mitropolitului și de trimitere în surghiun la Mănăstirea Slatina. A fost pus în aplicare chiar a doua zi, în ziua de prăznuire a Sfinților Arhangheli Mihail și Gavriil, când înconjurat de jandarmi, înaltul ierarh a urcat în trăsura ce l-a purtat către Mănăstirea Slatina, unde, nu cu mulți ani în urmă, tot în urma neînțelegerilor cu domnul, un alt mitropolit al Moldovei, Veniamin Costachi, își petrecuse ultimii ani ai vieții în surghiun.

S-a stabilit instituirea unui for de judecată alcătuit din 12 arhierei care urma să se întrunească pe 15 februarie 1861 pentru a judeca cazul mitropolitului Sofronie. Locțiitor de mitropolit a fost numit arhiereul Meletie Sardion. În ședința din 9 decembrie 1860, Adunarea legislativă a Moldovei a decis numirea unei comisii speciale formate din 5 membri care să analizeze hotărârea luată de guvern împotriva mitropolitului Sofronie. La 17 ianuarie 1861 comisia și-a prezentat concluziile cercetării pe care o făcuse, contestând acuzațiile aduse înaltului ierarh și acuzând guvernul de abuz de putere. Efectul a fost unul doar în plan politic, guvernul Kogălniceanu prezentându-și demisia. A doua zi, pe 18 ianuarie 1861, mitropolitul Sofronie a trimis domnului Alexandru Ioan Cuza actul de retragere a sa din scaunul mitropolitan al Moldovei:

„Prea Înălțate Doamne, din locuința mănăstirii Slatina, unde mă aflu petrecând, bolnav și necăjit; socotind că sfârșitul vieții mele cei amărâte se apropie, scurgându-se sănătatea mea din zi în zi; și cugetând în sigurateca mea locuință, cu durere vin, Prea Înălțate Doamne, a Vă ruga ca să binevoiți a încuviința retragerea mea din scaunul Mitropoliei Moldovei; și luând în considerație neobositele mele slujbe, ce în curs de 35 ani am făcut Statului; în care timp, puteți singur mărturisi, că nu am refuzat concursul meu la toate lucrările privitoare către nație; Vă mai rog, Prea Înălțate Doamne, ca să-mi fie învoită locuința mea în Capitalie (Iași), unde, din pricina boalei mele cronice de care sufăr, sunt silit a fi lângă doctorul în care am toată încrederea a mă căuta, ca unul ce-mi cunoaște toată boala mea; și cu toată smerenia sunt al Înălțimii Voastre către Dumnezeu rugător, Sofronie Mitropolitul Moldovei. 18 ianuarie 1861, mănăstirea Slatina” (Monitorul Oficial al Moldovei, 1861 apud Nestor Vornicescu).

Mitropolitul Sofronie Miclescu a murit în Iași, la 18 mai 1861. A fost prohodit în vechea catedrală din Iași cu hramul „Sf. Gheorghe” și potrivit dorinței sale a fost înmormântat în pridvorul Mănăstirii Neamț.