Fiind pizmuit de fratele său pentru averea sa, Iacov a plecat la Constantinopol, unde s-a dus la Patriarhie şi s-a spovedit chiar Patriarhului Nifon. Apoi şi-a împărţit averea săracilor şi a plecat în Sfântul Munte, unde a vizitat mai multe mănăstiri înainte de a intra ca monah la Mănăstirea Dohiariu.

Mai târziu, s-a dus la vestitul Schit al Sfântului Ioan Botezătorul, ce ţine de Mănăstirea Iviron. Acolo Iacov a trăit în foarte aspră nevoinţă, mâncând foarte puţin şi dormind încă şi mai puţin, dar sporind duhovniceşte zi de zi. Căutând şi mai multă linişte, s-a mutat mai înlăuntrul peninsulei athonite, împreună cu şase ucenici ce veniseră să stea cu el şi să înveţe de la el.

În urma unei vedenii, în anul 1518, Cuviosul Iacov a părăsit Athosul însoţit de ucenicii săi şi a vizitat oraşul Petra. De acolo s-a dus la Meteora, în Tesalia, unde a stat o scurtă vreme, iar de la Meteora s-a dus în satul numit Trevekista, lângă Nafpaktos. Oriunde mergea, veneau la el mulţimi de oameni, căci faima sfinţeniei sale mergea înaintea lui. Iacov propovăduia adeseori şi tămăduia mulţi oameni.

Lucrarea lui l-a deranjat mult pe Acachie, Mitropolitul din Arta, care pare-se că săvârşise unele nelegiuiri şi nu voia ca Sfântul Iacov să le descopere. Ca urmare, Mitropolitul din Arta l-a trădat pe Iacov beiului din Trikala, ca pe unul ce aduna oameni pe uscat şi pe mare pentru un scop tainic. O asemenea veste l-a supărat aşa de tare pe bei, încât a poruncit ca Iacov să fie legat şi adus îndată la el.

Este arestat și închis la Trikala, împreună cu ucenicii săi, iar de acolo va fi mutat la Adrianopol (Edirne), iar de acolo la Didymoteicho.

Simţind că Iacov nu va mai ieşi viu din această încercare, doi dintre ucenicii săi, părintele Teona şi fratele Iacov, i-au cerut poveţe privitoare la mănăstire şi la fraţii rămaşi acolo. Iacov l-a pus egumen pe părintele Teona şi a scris o scrisoare monahilor, îndrumându-i să se supună lui Teona ca lui însuşi. De asemenea, le-a cerut ca după moartea sa să slujească 40 de Sfinte Liturghii întru pomenirea lui.

Când a fost chemat ca să fie judecat, față de acuzațiile aduse, Cuviosul Iacov a răspuns că i-a adunat pe fraţii săi creştini ca să-i înveţe legea lui Dumnezeu ca ei să poată împlini poruncile Lui şi să nu se lase prinşi de nici un rău. După aceasta au fost dați spre a fi puși la cazne. Le-au pus şnururi în jurul capului, care au fost apoi strânse, pricinuindu-le dureri cumplite. Dar indiferent ce le-ar fi făcut ostaşii, toţi trei au rămas neclintiţi în ortodoxia lor. Văzând că nimic din toate acestea nu-i clintea pe mărturisii lui Hristos, i-au osândit la moarte prin spânzurare.

Sfântul Mucenic Iacov, și cei împreună cu el, Iacov diaconul și Dionisie monahul au fost spânzurați la Adrianopol în ziua de 1 noiembrie a anului 1519. Moaştele lor au fost luate mai târziu de creştini evlavioşi, care le-au îngropat la trei mile în afara satului lor natal, numit Arvanitohori, în trei morminte aparte.

După cinstitul sfârșit al celor trei mucenici, ucenicii sfântului, povăţuiţi de Sfântul Teona, au mers și au viețuit la Mănăstirea Simono-Petra. Mai apoi au luat moaștele celor trei cuvioşi, iar după trei ani le-au mutat la Mănăstirea Sfintei Anastasia Farmacolitria, în apropiere de Tesalonic, unde se păstrează până astăzi. O parte din moaștele acestor cinstiți mucenici se păstrează și la Mănăstirea Iviron.