Necunoscută locuitorilor Ierusalimului din vremea Mântuitorului, aceasta este peştera în care obişnuia Iisus să vină şi să le vorbească ucenicilor. Peştera Ghetsimani este locul în care Hristos i-a lăsat pe cei opt Apostoli, când a plecat câţiva metri mai încolo să se roage, luându-i cu el doar pe Petru, Ioan şi Iacov. Tot aici s-au ascuns ucenicii după arestarea Mântuitorului.

În această grotă, anumite grupări de creştini comemorau Cina Domnului şi spălarea picioarelor ucenicilor. Către anul 530, pelerinul Teodosie scria: „Acolo este valea lui Iosafat; acolo Iuda L-a trădat pe Domnul. Acolo, este biserica Doamnei Maria, Maica Domnului. Acolo Domnul a spălat picioarele ucenicilor Săi şi a luat cina; acolo se găsesc patru bănci pe care Domnul S-a aşezat în mijlocul ucenicilor; acest loc se află într-o grotă”.

Din 1361 până la sfârşitul secolului al XIX-lea, peştera a fost considerată mai mult un loc public, în care musulmanii îşi adăposteau adesea animalele. Franciscanii au reuşit să o cumpere în 1682.

În anul 1952, când s-au efectuat lucrări de curăţare şi reparație a peşterii în urma unor aluviuni puternice, au ieşit la iveală resturi de mozaic din secolele IV-VI.

Astăzi, în interiorul Peşterii din Ghetsimani se păstrează trei altare.